由于抗生素的滥用所导致细菌耐药问题日益严重，快速检测细菌耐药已成为迫切需要解决的问题。在本文的研究中，我们同时结合了图像拼接算法、图像识别算法、拉曼光谱处理和寻峰算法，可对多个高倍物镜视场进行拼接，并识别和定位到单个细胞判别是否为抗生素耐药菌。解决了高倍率视场中单个细胞数量少、不同拉曼光谱寻峰参数不同导致的数据精度低、人工实验量大、效率低等问题。具有自动、高通量、快速、准确的鉴定特点，可作为一种无人值守、通用、无创的耐药菌检测手段，筛选有效抗生素，对研究抗生素在细菌病原体中的持久性和传播具有重要意义。

本研究中采用单细胞拉曼重水同位素标记技术，引入了一种图像拼接算法和自动识别算法，该算法可以根据设定的单细胞数量自动计算出需要拼接的小视场数目，有效避免了冗余拼接，提高了拼接和识别的效率，从而实现了图像拼接和单细胞识别的全自动。此外，在拉曼光谱的寻峰部分，加入了自适应迭代重加权惩罚最小二乘(airPLS)算法和寻峰算法，实现了拉曼光谱指纹的精确定位，以及快速识别2030-2400 cm^-1范围内拉曼光谱是否存在C-D峰，实现了样品中所有细菌拉曼光谱的全自动分析。本文的研究方法实现了单细胞的高通量鉴定和拉曼光谱的获取，使实验结果更加可靠，实现了细菌抗菌药物耐药性的无人值守自动鉴定过程。

图1.流程图

为了同时能对多个高倍视场中的细菌进行高通量的识别判定，本文中引入了图像拼接技术。图像拼接主要包括图像识别、图像配准、全局优化和图像融合四个阶段。为了实现拼接视野数的自动计算以提高效率，本文采用的方法是根据用户输入的待测细菌数计算最终拼接视野数。图像拼接的流程图如图2所示。为了自动计算拼接图像的数量，在获取小视场图像的同时进行图像识别。将所获取图像的未重叠区域中已识别的细菌数量累积起来，并与用户已设置要检测的细菌数量进行比较，以确定是否继续获取图像。为了保证拼接后的细菌数量，如果扫描某一行后，累积的细菌未达到用户设置的数量，则直接扫描下一行的所有细菌。

图2. 多视场图像拼接流程图

为了能够准确识别和定位单个细胞并排除杂质和簇现象，首先需要对输入图像进行预处理以减少图像上的噪声（图3A）,根据面积、圆度、偏心率、凸度等特征来过滤得到目标细胞（图3D）。我们对已识别的细菌进行编号，以便快速准确地定位它们，并在必要时提供验证其拉曼光谱的帮助。由于生物样品拉曼光谱的峰位置与簇现象的峰位置存在明显差异，因此排除了杂质和簇现象。图3E、F分别显示了在具有过多簇现象的小视场中和在具有过少单细胞的小视场中对单细胞的筛选。

图3.图像识别示意图

大量研究报道抗生素耐药细菌和敏感细菌之间的分子结构存在差异。图4C、D分别显示实验1和实验2的抗生素抗性细菌和敏感细菌的拉曼光谱图像，图中显示，耐药菌在2040-2300 cm^-1波数范围内出现重水峰。结果表明，在反硝化过程中，基于烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(NADPH)的H+/D+交换反应是同步进行的，并且从D?O中掺杂氘，这与细菌的代谢活性有关。敏感菌由于被抗生素浸泡而失去了活性，因此，当用重水标记敏感菌时，由于不与氘反应，拉曼光谱中没有C-D峰。

图4. 多个视场拼接以及耐药菌和敏感菌的拉曼光谱对比图以及耐药菌和敏感菌分布及其放大细节图

为了实现高通量、快速、准确的细菌耐药性检测，我们提出了基于图像拼接技术的细菌多视场拉曼光谱快速检测与分析方法。本文研究的方法以单细胞拉曼光谱为核心，结合同位素标记，集成多种算法进行优化，根据用户输入的细菌数量自动计算拼接的小视场数，并在设定的峰间隔内确定有无峰，实现细菌抗菌药物耐药性无人值守的自动化鉴定。结合重水标记技术和拉曼光谱技术，实现了抗生素敏感性试验中单细胞抗生素耐药性自动无监督分析的全过程。多视场自动分析细菌拉曼光谱方法可以准确识别单细胞，准确识别细菌抗生素耐药性(正确率为99.8%)。结果表明，多视场自动分析细菌拉曼光谱方法能够快速、准确地分析细菌耐药性。因此，多视场自动分析细菌拉曼光谱方法可作为一种高通量、快速、准确的细菌拉曼光谱耐药性检测方法，将有利于医学领域和微生物学领域用于研究抗生素在细菌病原体中的持久性和传播。

原文链接：

https://doi.org/10.31083/j.fbl2810249